酵素作用

一、                材料與方法:

實驗樣品:

唾液

本氏液

澱粉緩衝液(5g/l)

1% 氯化鈉

0.1M 磷酸鹽緩衝溶液(PH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)

澱粉酶

0.1M NaOH

Dinitrosalicylate 試劑

蒸餾水

實驗器具:

Pipette

eppendorf

水浴槽

烘箱

分光光度計

eppendorf

滴支

方法:
(一)澱粉酶

1.     將eppendorf1、2分別加入6mL 1%澱粉液。

2.     在eppendorf1中加入2mL唾液，eppendorf2中加入2mL蒸餾水。

3.     將兩eppendorf放置於37℃之水浴中，15分鐘後取出。

4.     兩eppendorf各加入2mL本氏液。

5.     將兩eppendorf放置於沸水加熱10分鐘，觀察顏色的變化。

(二)定出澱粉酶作用的最適時間

1.準備8支eppendorf，分別加入下列溶液:

澱粉緩衝液(5g/L)	0.625mL
0.1M磷酸鹽緩衝溶液(ph6.5)	0.25mL
氯化鈉10(g/L)	0.125mL

2.將此8支eppendorf封好石臘膜後，放置於37℃水浴中，10分鐘後取出。

3.將0.125澱粉酶加入其中7支eppendorf(實驗組)，另外1支加入0.5mL的蒸餾水作為對照組。

4.將實驗組的7支eppendorf放置於37℃水浴中，分別放置0、5、10、15、20、30、40分鐘。

5.時間一到，加入0.5mL 2M氫氧化鈉，以停止反應。

6.於全部eppendorf中加入0.125mL 3,5-Dinitrosalicylic acid，並在沸水浴中加熱5分鐘後取出，冷卻至室溫。

7.取1mL的液體以光電比色計，測其吸光度(OD540nm)，並以圖表表示澱粉酶與作用時間的關係。

(三)澱粉酶作用的最適溫度

1.準備5支eppendorf，分別加入下列溶液:

澱粉緩衝液(5g/L)	0.625mL
0.1M磷酸鹽緩衝溶液(ph6.5)	0.25mL
氯化鈉10(g/L)	0.125mL

2.取4組的微量離心支(實驗組)封好石臘膜，放置於不同溫度的環境(25℃、37℃、50℃、60℃)，放置時間為實驗二所測得出來的時間(本組為5分鐘)。

3.時間一到，加入0.5mL 2M氫氧化鈉，以停止反應。

4.於全部eppendorf中加入0.125mL 3,5-Dinitrosalicylic acid，並在沸水浴中加熱5分鐘後取出，冷卻至室溫。

5.取1mL的液體以光電比色計，測其吸光度(OD540nm)，並以圖表表示澱粉酶與作用溫度的關係。

(四)澱粉酶作用的最適酸鹼度(pH)

1.準備5支eppendorf，分別加入下列溶液:

澱粉緩衝液(5g/L)	0.625mL
氯化鈉10(g/L)	0.125mL

2.將5支eppendorf分別加入pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸鹽緩衝溶液0.25mL。

3.將此5支eppendorf封好石臘膜後，放置於實驗(二)、(三)所測出來的最適溫度與時間。(放置於60℃水浴中，5分鐘後取出。)

4.於全部eppendorf中加入0.125mL 3,5-Dinitrosalicylic acid，並在沸水浴中加熱5分鐘後取出，冷卻至室溫。

5.取1mL的液體以光電比色計，測其吸光度(OD540nm)，並以圖表表示澱粉酶與酸鹼度的關係。

二、              結果:

(一)   澱粉酶

觀察哪一試管中含有葡萄糖，為什麼?

有加入唾液的eppendorf呈現橘紅色，代表試管一中含有葡萄糖，加入2mL蒸餾水的eppendorf不變色，因為唾液中含有澱粉酶，可以分解澱粉成葡糖糖，葡萄糖遇到本氏液依照葡萄糖濃度由高至低呈現紅橙黃綠色。

(二)   定出澱粉酶作用的最適時間

澱粉酶作用的最適時間:5分鐘。

OD540Absorbance
amylase作用時間	1repeat	2repeat	3repeat	average	STDEV	校正數據
control group	0.036	0.108	0.096	0.080	0.039	0.000
0	1.566	2.881	2.397	2.281	0.665	2.201
5	1.897	2.838	2.577	2.437	0.486	2.357
10	1.387	2.877	1.775	2.013	0.773	1.933
15	0.746	2.806	2.721	2.091	1.166	2.011
20	0.932	2.814	-0.008	1.246	1.437	1.166
30	1.272	-0.014	-0.013	0.415	0.742	0.335
40	0.423	-0.012	-0.03	0.127	0.257	0.047

澱粉酶作用5分鐘有最高的吸光值，如果是比較標準差的正差的話，是15分鐘的組別有最高的吸光值，但是因為標準差明顯大出5分鐘的標準差，因此本組推論澱粉酶的最適作用時間為5分鐘。

(三)   澱粉酶作用的最適溫度

澱粉酶作用最適溫度:60℃。

OD540Absorbance
amylase作用溫度(℃)	1repeat	2repeat	3repeat	average	STDEV	校正數據
control group	0.597	0.142	0.045	0.261	0.295	0.000
25	1.087	1.996	2.075	1.719	0.549	1.458
37	2.133	2.036	2.125	2.098	0.054	1.837
50	1.783	2.105	1.988	1.959	0.163	1.697
60	2.23	1.973	2.133	2.112	0.130	1.851

本組當初選擇60℃作為澱粉酶的作用最適溫度，因為60℃組別中的吸光值最高。

(四)澱粉酶作用的最適酸鹼度(pH)
澱粉酶作用最適酸鹼度:pH7.5

OD540Absorbance
pH	1repeat	2repeat	3repeat	average	STDEV
6.00	1.058	0.937	1.001	0.999	0.061
6.5	1.071	0.971	0.872	0.971	0.100
7	1.141	1.036	0.958	1.045	0.092
7.5	1.027	1.101	1.014	1.047	0.047
8	0.997	0.838	1.091	0.975	0.128

pH7.0與pH7.5其實值只差0.02，之所以選擇pH7.5是因為他的表準差較小。

三、                問題討論:

1.      實驗一就觀察結果，哪一管含有澱粉酶?為什麼是這種變化的結果?
第一管含有唾液的試管含有澱粉酶，因為加入本氏液後呈現橘紅色，代表澱粉已經被分解成還原醣(葡萄糖、麥芽糖)；我們人體的唾液含有澱粉酶，為的就是可以初步分解澱粉這大分子成葡萄糖或麥芽糖這些小分子，讓人體能吸收。

2.      酶之變性受哪些因子所影響？
重金屬鹽:
重金屬陽離子可以和蛋白質中游離的羧基形成不溶性的鹽，造成蛋白質的沉澱。
強酸、強鹼:
強酸、強鹼可以使蛋白質中的氫鍵斷裂；也可以和游離的氨基或羧基形成鹽，造成蛋白質的沉澱。
尿素、乙醇、丙酮:
尿素、乙醇、丙酮提供自己的羥基或羰基上的氫或氧去形成氫鍵，從而破壞了蛋白質中原有的氫鍵，使蛋白質變性。
加熱、紫外線照射、劇烈振蕩等:
破壞蛋白質分子中的氫鍵，但在變化過程中也沒有化學鍵的斷裂和生成，沒有新物質生成，因此是物理變化。

3.      解釋實驗三、四所畫的曲線圖的意義。
實驗三的曲線圖可以看出澱粉酶作用的最適合溫度，實驗四的曲線圖可以看出澱粉酶作用的最適合時間；本組測得澱粉酶反應的最佳溫度是60⁰C，而最佳pH值是pH7.5。而查到的資料顯示:澱粉酶作用溫度範圍60～90℃，最適宜作用溫度為60～70℃，作用pH值範圍5.5～7.0，最適pH值為6.0。

4.為何實驗以氫氧化鈉停止酵素反應，不用加熱或加入強酸來停止酵素反應?
因為3,5-Dinitrosalicylic acid要在鹼性環境下才可以與葡萄糖反應，產生暗棕色的3-Amino-5-nitrosalicylic acid，3-Amino-5-nitrosalicylic acid可以吸收波長540nm的光，藉由測540nm吸光度，就可以知道溶液中還原糖的多寡。

excel圖表樣本:

https://drive.google.com/file/d/0By6NVyKknVV-SDFTSmxEVWVXajg/view?usp=sharing